فلوسایتومتری

بسیاری از فلوسایتومترهای امروزی شامل ترکیبی از مدارهای دیجیتال و آنالوگ جهت اندازه گیری فوتون های رسیده از ذرات عبوری از پرتو لیزرهستند. چون این فوتون ها با سایر فوتون های غیر مرتبط با نمونه همراهند برای رسیدن به نسبت سیگنال به نویز بالا باید از فیلتر جهت نویزهای نوری استفاده کرد

بسیاری از فلوسایتومترهای امروزی شامل ترکیبی از مدارهای دیجیتال و آنالوگ جهت اندازه گیری فوتون های رسیده از ذرات عبوری از پرتو لیزرهستند. چون این فوتون ها با سایر فوتون های غیر مرتبط با نمونه همراهند برای رسیدن به نسبت سیگنال به نویز بالا باید از فیلتر جهت نویزهای نوری استفاده کرد. فیلتر مضاعفی نیز جهت کاهش نویز الکترونیکی دستگاه ها استفاده می شود. جهت کاهش دریافت نویز محیطی، از پنجره دریافت با پهنای قابل تنظیم استفاده می شود. پس از دیجیتال‌کردن داده ها، جبران سازی رنگی با استفاده از وارون ماتریس جبری خطی انجام می گیرد و از جداول جستجو جهت تبدیل خطی به لگاریتمی استفاده می شود.

پیشرفت های زیاد در طراحی این دستگاه و اتوماتیک کردن آن نشان داده است که ، بدون کنترل شدید و کالیبره دقیق، داده های نادرستی به دست می آیند . برای کاهش این احتمال،باید طـراحان این دستگاه ها با همکاران متخصص بـیـولوژیست، شیمی‌دان و  پزشکی خود برای توسعه و بهبود عملکرد این دستگاه ها مشورت و همکاری  کنند.

فلوسایتومتری چیست؟
سـیـتـومـتـری تـکـنـیکی است که اندازه گیری ســلـول ها را انـجام مـی دهد. مـعـمــولاً اندازه‌‌گیری‌های سیتومتریک از طریق روش های میکروسکوپی انجام می پذیرد. فلوسایتومتری مربوط به همین نوع اندازه گیری است بطوری که اندازه گیری ها در حالی که جریان سلول ها از مقابل آشکار سازهای نوری عبور می کنند انجام می شوند. فلوسایتومتری همان انواع روش های انـدازه‌گـیـری را دارد کـه تـوسط میکروسکوپ (فلورسانس) انجام می شود:
‌تعیین ابعاد سلول
‌اتوفلورسانس

فلوسایتومتر چگونه کار می کند؟بـه طـور خـلاصه، توصیف غیر تکنیکی نحوه عملکرد فلوسایتومتر در ادامه ارائه شده‌است. یک سیستم فلوسایتومتر از بخش های متعددی تشکیل یافته است:
‌سیستم حامل سیال جهت انتقال نمونه
‌سیستم نوری جهت انجام اندازه گیری
‌الکترونیک مورد استفاده جهت آشکارسازی سیگنال، پردازش داده ها و عمل اتوماسیون
‌رابط کامپیوتری، نرم افزار و سخت افزار مورد استفاده برای کنترل فلوسایتومتر و جمع آوری، نمایش و ذخیره داده ها
در  این مقاله  در مورد بخش سیال و سیستم نوری بحث می شود.

سیال یا fluidics
خصـوصیـت اصلـی یـک سیستـم فلـوسـایتـومتـر این است که اندازه گیری ها برای نمونه‌های سلولی که در دستگاه جریان می یابند انجام می گیرند. اگر به طور ساده از یک لوله جهت انتقال نمونه استفاده کنیم سلول ها  نمی توانند به طور مکرر به نقطه اندازه گیری (محل برخورد لیزر به سلول ) بروند.
‌اگر از لوله های باریک تر جهت اطمینان از انتقال تکرار پذیر سلول ها استفاده شود احتمال دارد  با عبور سلول های بزرگتر منجر به بسته شدن مسیر شوند. برای حل این مشکل از روش کانونی هیدرودینامیک)  Hydrodynamic Focousing( استفاده می شود. در این روش جریان آرامی از سلول ها را به‌درون جریان حامل سریع، وارد می کنند. مایع حامل، سلول ها را در مرکز لوله متمرکز می کند ، بنابراین سلول ها به طور تکرار پذیری ب و در سک ردیف در مسیر مجازی به نقطه اندازه گیری منتقل می شوند.

سیستم اپتیکیسیستم اپتیکی فلوسایتومتر متشکل از یک یا چند منبع نوری به همراه یک سری از عدسی ها، فیلترها و آشکارسازها  است. عدسی ها و فیلترها جهت انتقال نور منبع به نقطه اندازه گیری و نیز برای انتقال نور پراکنده و فلورسانس از نقطه اندازه گیری به آشکارسازها به کار می روند. انواع مختلفی از منابع نوری برای فلوسایتومترها وجود دارند که به شرح زیرهستند:
‌لیزر: ‌لیزرها دارای این مزیت هستند که منبع نور تک رنگ-تک طول موج هستند. این موضوع در جداسازی نور پراکنده از نور فلورسانس به ما کمک می کند.
پرکاربردترین لیزرها لیزر یون آرگون ‌با طول موج ۴۸۸ نانومتر و لیزر He-Ne با طول موج  قرمز  ۶۳۳ نانومتر هستند.
لیزرهای دیودی ‌نیز به  دلیل پایداری و قیمت ارزان مورد استفاده قرار می گیرند و معمولاً طول موج ۶۳۵ نانومتر  ‌ استفاده می شود.
لامپ های قوسی: بر خلاف لیزرها نور سفید دارند و نور محرک با استفاده از فیلتر انتخاب می شود. معمولا   لامپ های Xe و جیوه بیشتر به کار می روند.

فیلترهافیلترهای نوری فقط طول موج های خاصی را عبور داده و مانع عبور سایر طول موج‌ها می شوند. دو نوع فیلتر اصلی مورد استفاده در فلوسایتومتری  در شکل ۱  نشان داده شده اند. فیلترهای dichroic یا دو رنگ نما و فیلتر باند عبوری. فیلترهای dichroic یا دو رنگ نما ‌آینه های انتخابی هستند که اجازه عبور طول موج های بلند را می دهند و طول موج های کوتاه را منعکس می کنند.  ‌فیلتر باند عبوری ‌جهت عبور باند باریکی از طول موج بین nm 640-620 طراحی شده است.  ‌در شکل ۲ شمای کلی از یک سیستم فلوسایتومتری شاهد می شود. در این شکل مجموعه زیادی از فیلترها برای جداسازی نورهای حاصله به باندهایی که بیانگر پراکندگی توسط سلول و فلورسانس ناشی از ترکیبات مختلف آن ها است به کار رفته‌اند.

آشکارسازهابـا عبـور ذرات یـا سلـول هـا از مقـابـل پـرتـو لیـزری در فلـوسایتومتر، مولکول های فلورسانس سطح سلول فوتون هایی  با طول موج خاص در همه جهات تابش می کنند. سیستم اپتیکی سیتومتر بخشی از این فوتون‌‌ها را به آشکارسازها می رسانند.

چرا استفاده از فلوسایتومتری؟فـلــوســایـتــومـتــری اســاســا  انــدازه گـیـری هـایـی را انجـام مـی دهـد کـه قبـلا تـوسـط میکروسکوپ فلورسانس انجام می شده است. ولی روش میکروسکوپی قدیمی دارای اشکالات متعددی است که برخی از آن‌ها عبارتند از:
‌روش پر زحمت و کندی است. به طور عملی با این روش می توان در دقیقه حدود ۱۰۰ سلول یا بیشتر را شمارش کرد اما اگر اندازه‌گیری های بیشتری نیاز باشد نیاز به صرف وقت زیادی است.
‌تجزیه و تحلیل میکروسکوپی نمونه ها با چشم باعث خستگی اپراتور شده که بر صحت نتایج اثر می گذارد.
در نـتـیجه مشکلات فوق معمولا سلول‌های کمی قابل آنالیز هستند. این امر اثر معکوسی بر خطای آماری به دست آمده دارد.

‌آنالیز میکروسکوپی غالبا کیفی است و در بهترین حالت نیمه کمی است. مثلا می‌توان بین سلول های رنگ آمیزی نشده و سلول های با رنگ قرمز تمییز داد اما در تعیین شدت رنگ ها نمی توان اظهار نظری کرد.
‌دقت روش میکروسکوپی بسیار وابسته به اپراتور است.
در مقابل، فلوسایتومتری دارای مزایای زیر است:
از آنجا  که  بررسی روی تک سلول ها انجام می‌گیرد نا یکنواختی نمونه قابل بررسی و کمی‌سازی است. این امر به ویژه برای سلول های با منشا طبیعی اهمیت بیشتری پیدا می‌کند.
‌این روش سریع است. سرعت سنجش  در اغلب روش های مرسوم و قدیمی حدود ۱۰۰۰ سلول در ثانیه است.
PMT مـورد استفـاده در فلـوسـایتـومتـری جهت تمیز سطوح مختلف رنگی بسیار بهتر از چشم انسان عمل می کند.
‌در ایـن روش خـصـوصـیات مختلف یک سلول مورد بررسی قرار می گیرند و در نتیجه انـدازه گـیـری هـای چـنـد پـارامـتـری قـابل انجام هستند.

کاربرد های مختلف فلوسایتومتری به شرح زیر  هستند:
‌تـعـیـیـن مـقـدار مـحتویات مختلف سلولی مثل پروتئین، چربی، DNA، RNA و …
‌تعیین اثر آنتی بیوتیک خاص
‌تعیین در صد فعالیت سلول های زنده
‌تعیین فعالیت آنزیم ها
‌طراحی سوبسترا  و …

الکترونیک فلوسایتومتر
فـلـوسـایـتـومترها از زمان ساخته شدن اولین دسـتـگــاه تـجــاری در ۳۰ ســال پـیـش پـیـشـرفـت سـریعی داشتند. این سیتومترها کاملا خودکار نبـوده انـد به طوری که اپراتور برای کار کردن می‌بایست به بخش های مختلف دستگاه از نظر علمـی آگـاهـی داشتـه بـاشـد. امـا بهبـود سـرعت بخش های مختلف الکترونیکی، کاهش ابعاد و مصرف انرژی کم باعث افزایش سرعت و حساسیت بیشتر این دستگاه ها شده است. اتوماتیک کردن فرایندهای پیچیده ای که قبلا نیاز به اطلاعات زیادی داشت باعث افزایش بیشتر کاربرد آن و نیز استفاده کاربران بیشتری از آن شده است.
می توان فلوسایتومتری را دهکده ای تصور کرد که اعضای این دهکده با زبان های کــامـلا متفـاوت از هـم مثـل اپتیـک، مکـانیـک سیـالات، بیـولـوژی، شیمـی، بیـوشیمـی، الکترونیک و آمار ریاضی صحبت می کنند  که هر کدام از این ها شاخه ای از علم و تخصص ویژه ای در دنیای امروز هستند.  ‌اگر به یک فلوسایتومتر قدیمی نگاه کنید آنچه که می بینید غالبا وابسته به سیالات است که شامل: شیر یا دریچه، سوپاپ تنظیم، شستی ها و پیچ های متعدد، شاخص یا صفحه عقربه دار، لوله ها و … هستند. ولی آنچه که امـروزه درون یـک دسـتـگاه فلوسایتومتر دیده می شود غالبا بخش های الکترونیکی هستند. در این مقاله به بخش‌های مختلف الکترونیکی یک سیستم فلوسایتومتر مدرن و نحوه عملکردشان  توجه شده است.بخش الکترونیک دستگاه به سه قسمت اصلی تقسیم می شود که عبارتند از:  الکترونیک بخش آشکارسازی، مدارهای اندازه گیری و مدارهای محاسباتی.بلوک دیاگرام بخش های مختلف الکترونیکی یک فلوسایتومتر به شرح زیر است:

۱- الکترونیک بخش آشکارسازی
مـا از لـغـت الـکـتـرونـیـک آشـکـارسـاز اسـتفاده کرده ایم تا مدارهایی را که عملکرد signal conditioning دارند، مانند: تغییرات فوتون به فوتوالکترون، تبدیلات جریان به ولتاژ، ذخیره سازی baseline، تقویت کننده، DC restoration و تمایز یا discrimination را توصیف  کنیم. مشکل اندازه گیری به ویژه برای فلورسانس کم نور و میرا این است که اندازه گیری ها باید در محیطی پر از نویز، نویزهای اپتیکی و الکترونیکی، انجام گیرند. وقتی سیگنال کوچکی روی نویز زمینه بالا قرار می گیرد، تغییرات سیگنال زمینه دقت اندازه گیری سیگنال های اصلی کوچک را محدود می کنند. روی هم رفته، محدودیت آشکارسازی سیگنال های کوچک توسط خطای نویز زمینه تعیین می شود. وظیفه الکترونیک آشکارساز این است که نسبت سیگنال به نویز را در اندازه گیری به بیشترین مقدار ممکن برساند.

آشکارسازهااز آنجا که  آنچه که در فلوسایتومتر اندازه‌گیری می شود نور با طول موج های مختلف است، فوتودیودها)PDs( و PMTs بخاطر حساسیت بالای آن‌ها به عنوان آشکارساز استفاده می‌شوند. ابتدا فوتون‌های رسیده از نمونه توسط آشکارسازها به فوتوالکترون تبدیل شده و سپس جریان الکتریکی آن به ولتاژ تبدیل می شود. در حالی که بازده فوتودیودها در تبدیل نور به فوتوالکترون بیشتر از PMTs  هستند، حساسیت PMTs به  دلیل  بهره زیاد داخلی آن‌ها بیشتر از PDs است. PMTs مورد استفاده در فلوسایتومترها دارای بهره نویز پایین در حد ۱۰ به هزار یا میلیون یا بیشتر هستند. بهره یک PMT پایین ترین بهره نویز ممکن برای دستگاه است، زیرا جریان الکترون های PMT درون خلا  اتفاق می افتد. شار الکترونی درون تقویت کننده در ماده جامد، فلز یا نیمه رسانا، اتفاق می افتد به طوری که گرمای تصادفی ایجاد شده ناشی از این حرکت باعث ارتعاش اتم ها و مولکول ها می شود که به این حالت تصادفی نویز گفته می‌شود.

تقویت کننده (trans-impedance)آشـکـارسـازهای PD و PMT در پاسخ به ورودی فوتون های نوری جریان یا شار الکترون تولید می کنند.  به دلیل این که سیستم‌های الکترونیکی ولتاژ را اندازه گیری و مقایسه می‌کنند  باید خروجی دتکتور  به ولتاژ تبدیل شود. تبدیل جریان به ولتاژ با عبور جریان یا شار الکتریکی از یک مقاومت انجام می گیرد. آنچه که اتفاق می افتد بر اساس قانون اهم قـابـل پیـش‌بینـی اسـت: ولتـاژ تـولیـد شـده بـرابـر حـاصلضرب جریان در مقاومت است و چون مـقــدار مـقــاومــت ثــابــت اسـت ولـتـاژ خـروجـی مستقیما متناسب با جریان ورودی است. مدار الـکـتـرونیکـی کـه ایـن تبـدیـل را انجـام مـی دهـد تـقــویــت کـنـنـده trans-impedance نـام دارد کـه می‌تواند در مدار بخش PMT جاسازی شود. این مـدار جـریان فوتوالکترون ها را به ولتاژ تبدیل کرده و تقویت خطی ولتاژ را فراهم می کند.

ذخیره و بازیابی کننده خط پایه
PDها و PMT ها آنقدر حساس هستند که اگر خـروجـی آن‌هـا را، در حالتی که هیچ نوری به بخـش حساس داخل آن‌ها نمی رسد، بررسی کنیم. قطاری از پالس های سطح پایین آشکار می‌شوند که توسط تابش‌های ترمویونیک ایجاد شده و به جریان تاریکی معروفند. این پالس ها ناشی از الکترون های تولید شده توسط دمای مـحیـط در فـوتـوکـاتـد درون PMT  هستنـد. اگـر آشـکـارسـاز سـرد نـگـه داشـتـه شـوند آهنگ این پـالـس‌هـا کـاهـش مـی یـابـنـد.  ‌عـلاوه بـر جریان تـاریـکـی نـورهـای سـرگـردانی نیز هستند که به آشکارساز می رسند که بر مکان جمعیت منفی در هیستوگرام اثر می گذارند. این نور می تواند نــاشــی از پــراکـنــدگــی رامــان Raman نــاشـی از درخشـش فیـلامـان ملتهـب و لـولـه لیـزر حاوی فیلتر نوری باشد  یا حتی می تواند ناشی از نور فلورسانس مایع باشد. این منابع نویز اثر نـامنـاسبـی بـر سیگنـال‌هـای سطح پایین دارند و به طور مؤثر اندازه پالس را به شکل غیر‌خطی افزایش می دهند، بنابراین باید از سیگنال اصلی در مدار اندازه گیری کم شوند. این عمل توسط مدار بازیابی base   line انجام می‌شود. این مدار مانند یک فیلتر پایین گذر عمل می کند و بخش جریان های DC نور سرگردان را حذف می کند.

مجزاگر یا تریگربرای اندازه گیری دقیق فوتون‌های رسیده از نمونه، وقتی که نمونه آماده است باید انـدازه گیـری شـروع شـود. بـرای تشخیـص آمـاده بـودن نمـونـه از حـد آستـانه یکی از پارامترهای مورد اندازه پارامتر مجزاگر یا تریگر‌ استفاده می شود.
اگر هدف  اندازه گیری ایمونوفلورسانس باشد پارامتر مجزاگر معمولا نور پراکنده به جلو به جای فلورسانس است زیرا تمامی سلول ها درجه ای از پراکندگی نوری را ایجاد می کنند  باید قادر به اندازه گیری فلورسانس ناشی از تمامی سلول ها، باشیم. به طـور معکوس اگر هدف اندازه گیری محتویات DNA سلولی باشد؛ معمولا  پارامتر فلورسانس DNA  به عنوان مجزاگر انتخاب می شود زیرا معمولا فلورسانس رنگی DNA سلول های بدون هسته مورد توجه نیستند.  ‌حد آستانه پارامتر مجزاگر بسته به نوع کاربرد انتخاب می شود، به طوری که هرگاه خروجی آشکارساز پارامتر مجزاگر بیشتر از حـد آستـانـه شود ذخیره سازی و تجمع سیگنال شروع می شود. هرگاه خروجی آشکارساز کمتر از حد آستانه پارامتر مجزاگر شود عمل جمع آوری سیگنال ها به پایان می رسد. تنظیم حد آستانه مجزاگر از نقطه نظر اپراتور مهمترین قسمت راه اندازی فلوسایتومتر است زیرا دستگاه می تواند فقط داده‌هایی را جمع آوری  کند که مقدار پارامتر مجزاگر آن بیشتر از حد آستانه باشد.

تقویت کننده
مدار دیگری که در انتهای دیگر سیستم الکترونیکی وجود دارد تقویت کننده بهره قـابـل بـرنـامـه ریـزی اسـت. تقـویـت کننده انتقال سیگنال های کوچک را به جایی که اندازه‌گیری قابل انجام است فراهم می کند. هر چند تقویت کننده ها دارای سطح نویز ذاتی بوده که می تواند در شرایط بهره بالا نسبت سیگنال به نویز را کاهش دهد. به این دلیل افزایش بهره و ولتاژ PMT جهت تقویت سیگنال بهتر از بهره تقویت کننده است.

‌توصیف خصوصیات پالس: سیگنال های انتگرال و قله
اندازه گیری ارتفاع پالس معمولا جهت اندازه گیری نور پراکنده یا شدت فلورسانس ذرات کوچک تا وقتی که قطر ذره به وضوح کمتر از قطر عمودی پرتو لیزر باشد، کافی است. هرچند اگر قطر ذره مشابه یا بزرگتر از پرتو لیزر شود ذره نمی تواند در یک لحظه به طور کامل تابش کند به علاوه فوتون های تابشی غالبا در ابتدا ناشی از لبه ورودی ذره، وسط و سپس کناره دیگر مسیر عبور ذره از راه پرتو لیزر  هستند.  به همین  دلیل تعداد فوتوالکترون های لحظه ای جمع آوری شده باید در کل عرض پالس با یکدیگر جمع شوند. این فرایند که انتگرالگیری نام دارد کمی سازی نور پراکنده و شدت فلورسانس ذرات بزرگ تر را فراهم می کند.

انتگرال گیر
در فلوسایتومترهای امروزی انتگرال گیری توسط تقویت کننده هایی انجام می گیرد که باند عبوری پایین داشته که توسط فیلتر پایین گذر الکترونیکی محدود می شوند. هر‌گاه ذره از پرتو لیزر عبور کند خروجی تقویت کننده آنقدر آهسته افزایش می یابد که خروجی آن واقعا انتگرال پالس اصلی تا مقدار قله آناست. انتگرال گیری غیر فعال به سمت انتگرال گیری فعال سوق داده می شود به طوری که سوئیچ های سریع مسئِول عمل تریگر هستند و بار خازن را کنترل می کنند. بار کل روی خازن در انتهای هر بار اشبـاع مجـزاگر باید دقیقاً متناسب با سطح زیر منحنی باشد.

آشکارسازی همزمان
یکـی از مشکـلات عمـده در فلـوسایتومتری وجود دوتایی ها یا حتی تجمع بیش از حد نمونه اســــــت. در ســیــتـــــومــتـــــری اســتـــــاتــیـــــک مــثـــــل میکروسکوپ نوری؛ چشم مشکلی جهت تمیز دادن یــک سـلــول قــرمــز و یـک سـلـول سـبـز در روبروی همدیگر بر روی اسلاید ندارد. هرچند در فلوسایتومتری که در هر ثانیه هزاران سلول  ازپرتو لیزر عبور می کنند، سلول های سبز که بلافاصله پس از سلول قرمز می آیند می توانند به عنـوان یـک سلـول سبـز و قـرمـز، مثبت دوگانه، شمـارش شـونـد. بـرای بـه حـداقل رساندن این احتمال اپراتور، قله یا ارتفاع پارامتر مجزاگر را انـتـخـاب مـی کنـد زیـرا در قلـه زمـان افـزایـش و کاهش سریعی دارد  بنا براین به مجزاگر اجازه می دهد تا در حد کمتر از حد آستانه بین دو سلول نزدیک به هم قرار بگیرد.

۲- الکترونیک اندازه گیری
الکترونیک اندازه گیری ولتاژهای آنالوگ را به عدد تبدیل می کند که رقمی کردن نام دارد. کارخانجات مختلف سازنده فلوسایتومتر این عمل را به روش های مختلفی انجام می دهند اما نتیجه نهایی آن ها یکسان است: نمونه در نهایت با مقادیر دیجیتالی نمایش داده می شوند ( یک فایل list mode) به طوری که توسط کامپیوتر قابل آنــالـیــز و تـجـزیـه و تـحـلـیـل هـسـتـنـد. داده هـای دیجیتالی دارای مزایایی هستند زیرا تمام اعمالی که روی داده های دیجیتالی انجام می گیرد بسیار ســریــع‌تــر انـجــام مــی گـیـرد. انتقـال  بـازیـابـی یـا آرشیوی مثل تبدیل scale خطی به لگاریتمی، جـبـران سـازی فـلـورسـانس، پنجره سازی و … همگی به طور کلی با دقت و سرعت بالایی روی داده های دیجیتالی انجام پذیر هستند.

مدارهای  Peak Sample-and-Holdاولین گام در فرایند اندازه گیری در یک زمان منظم کردن تمامی مقادیر قابل دیجیتال است. برخی از این مقادیر ممکن است قله بوده و برخی پـهـنـای پـالـس و بـرخـی دیگر سطح زیر منحنی باشند این امر می تواند مشکل زمانی برای فرایند انـدازه گـیـری هـای بـعـدی فـراهـم  کـنـد. تمامی داده‌ها در قله سیگنال در ارتفاع پالس قرار دارند.  مـی تـوان  از آنچه که در قله پالس پس از بالاترین نقطه پالس است صرفنظر کرد و اندازه‌گیری‌های کاملا معتبری به دست آورد.  ‌برای دیجیتالی کردن تمامی مقدار جمع آوری شده ، قله، پهنا و انتگرال ، باید مقادیر آن ها را تا زمانی که به بیشترین مقدار خود می‌رسند ذخیره  کنیم. Peak Sample-and-Hold یا مدارهای پالس کشیده این عمل را انجام می‌دهند. آن ها مقادیر تمام پارامترهای جمع‌آوری شده را تا زمانی که دیجیتالی شوند ذخیره می کنند. دستگاه های مدرن امروزی دارای چندین لایه مدار  Sample-and-Hold بوده که پالس ها را به شکل لوله ای عبور می‌دهند ،بنابراین در حالی که پالس های قبلی اندازه گیری شده اند سلول های جدید   رسیده برای شمارش از دست نمی روند.

مبدل  ADدر سال ۱۹۷۵ نشان داده شده است که اگر فرکانس نمونه برداری به اندازه کافی بزرگ باشد نمونه های دیجیتالی مجزا با استفاده از تابع کلی درونیابی می توانند با هم ترکیب شده و یک سیگنال آنالوگ پیوسته تشکیل دهند. وظیفه ADC ها عمل دیجیتالی کردن است یعنی تبدیل ولتاژهای آنالوگ، معمولاً بین صفر تا چند ولت، به مقادیر مجزای دیجیتالی(۰و۱٫)  ‌امروزه بیشترین بحث اصلی روی مزایای دیجیتالی کردن مستقیم پالس بلافاصله پس از تقویت کننده به جای استفاده از مدار انتگرال گیر و مدار peak   sample    and    hold و سپس دیجیتالی کردن داده های ذخیره شده است. تفاوت بین این دو روش این است که در روش دیجیتال کردن مستقیم پالس به ازای هر پارامتر در هر رویـدادی تعـداد زیادی مقادیر دیجیتال داریم. ولی در روش دیجیتالی کردن با مدار انتگرال گیر و مدار پالس کشیده به ازای هر پارامتر در هر رویدادی یک مقدار دیجیتال نسبت داده می شود.  ‌ کارایی و عملکرد ADC ها با دو پارامتر توصیف می شوند: سرعت بر حسب MHz و رزولوشن بر حسب بیت‌. سرعت ADC در روش دیجیتالی مستقیم مهم است زیرا اگر بخواهیم ارتفاع یا مقدار قله یک پالس را با خطایی کمتر از %۱/۰‌ به دست آوریم به نمونه ای نیاز داریم که ارتفاع پالس آن ۱۲۰ برابر باشد. اگر دستگاه سیتومتر پهنای پالسی برابر s 3 داشته باشد و ADC آن ۴۰ میلیون تبدیل در هر ثانیه انجام دهد نیاز به دقتی برابر ۱۲۰ اندازه گیری به ازای هر پالس داریم.

مدار همزمان سازیفلوسایتومترهای امروزی از طریق اتصال دستگاه های متعدد و سخت افزارهای محاسبه منطقی که کل پردازش را انجام می دهند به حالت شبه هوشمند رسیده اند. عملکرد ترکیبات مختلف انتهایی و الکترونیک اندازه گیری با مدار همزمان سازی با یکدیگر هماهنگ می شوند.  ‌ماشین های حالت به طور پیوسته  بررسی می کنند که آیا مدار  تریگر‌ اشباع شده است و سپس مدار انتگرال گیر و peak  sample  and  hold را فعال می کند. حال می توان گفت که پنجره دریافت داده باز است. سیگنال های زمان )clock( تا وقتی که مدار مجزاگر اشباع نشده باشد شمارش می کند، که پهنای سیگنال را می‌سازد. وقتی مدار مجزاگر اشباع می شود مدارهای انتگرال گیر و  sample   and     hold قطع می شوند و پنجره دریافت داده بسته می شود. در مرحله بعد ADC فعال شده و و بار ذخیره شده در مدار  sample    and   hold را خوانده و ولتاژ آن را به مقادیر عددی متناظر با هر رویداد تبدیل می کند. پس از انجام عمل ADC داده ها به الکترونیک محاسباتی داده می شود و ماشین های حالت،مقدار انتگرال گیرها و مدار  sample    and    hold را صفر می‌کند،   بنابر این پالس بعدی بدون دخالت پالس قبلی ثبت می شود.

۳- الکترونیک محاسباتیالکترونیک محاسباتی، معمولا  یک کامپیوتر در نزدیکی سیتومتر، نرم افزار دریافت داده را فعال کرده که عملیات وابسته به تحلیل و نمایش داده ها مثل تنظیمات ذخیره‌سازی و بازسازی داده، جبران سازی رنگی، مرتب سازی، تبدیل خطی به لگاریتمی و … را انجام می دهد.

جبران سازی فلورانس
۲۰ سـال پیـش در ۱۹۸۰ جبـران سـازی رنـگ فـلـورسـانـس از یـک رنـگ به کانال فلورسانس مـجاور توسط تفریق آنالوگ انجام می گرفت. تفریق آنالوگ دو رنگ نیاز به دو مدار دارد؛ که هر مدار مقدار سیگنال تنظیم شده با کاربر از یک رنگ را از سیگنال های رنگ دیگر کم می‌کند. برای ۳ رنگ به ۶ مدار و برای ۴ رنگ به ۱۲ مدار و برای ۵ رنگ به ۲۰ مدار نیاز است. علاوه بر نیاز به اپراتور برای تنظیم این مدارها، هر مداری نویز الکترونیکی خاص خودش را دارد. بسیاری از فـلــوسـایـتـومـتـرهـای امـروزی داده‌‌هـای جـبـران نشده را جمع آوری می کنند؛ اپراتور الکترونیک مـحــاسـبــاتــی را بــرنـامـه ریـزی مـی‌کنـد تـا عمـل جــبــران‌ســازی بــا اسـتـفــاده از روش مـعـکــوس ماتریس جبر خطی انجام گیرد.

تبدیل لگاریتمی
حدود چندین سال پیش تبدیل داده های خطی بـه لگاریتمی توسعه یافته است؛ مزیت استفاده از تـبـدیـل لـگـاریـتمی این است که می توان محدوده دینامیک  وسیعی از شدت های فلورسانس را نشان داد. ایـن تـابـع در ابـتـدا تـوسـط تـقـویـت کـننده های لـگـاریـتـمـی انـجـام مـی شـد امـا درسـتـی ایـن تـبـدیـل نـــادرســـت بـــود زیــرا تـقــویــت کـنـنــده هــای نــوعــی لگاریتمی دارای نویز زمینه و offset هستند که بر مشاهده جمعیت ها تاثیر می گذارند. این تقویت کننده  ها دارای خطایی در حد ۲۰% بوده اند. امروزه اگر داده های لگاریتمی مورد نیاز باشند الکترونیک محاسباتی یا کامپیوتر به سادگی مقادیر متناظر داده های خطی را در جداول جستجو یا LUT جستجو و پیدا می کنند، بنابراین اگر رزولوشن ADC به اندازه کافی باشد خطا کاهش می یابد.

مهندس علی اصغر پرچ، اعظم عسگری

منابع:

[۱]Christopher “Kit” Snowm, Flow Cytometer Electronics. Cytometry Part A 57A:63-69 (2004)
[2]Rafael Nunez, Flow Cytometry: Principles and Instrumentation, Curr. Issues Mol. Biol. (2001) 3(2): 39-45
[3]C. Bruce Bagwell. Software Compensation for Flow Cytometry. 25th Annual Course in Cytometry.2003
[4]Dr Hazel Davey. Flow Cytometric Methods. In: http://pcfcij.dbs.aber.ac.uk/index.html